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与CRISPR旗(qi)鼓相(xiang)当的新一代RNAi

【字体: 时间:2015年06月17日 来源:生物通

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  此前,加州(zhou)大(da)学旧金山分校的(de)(de)研究(jiu)团队通过(guo)建立超复杂混(hun)合shRNA文库,在(zai)(zai)很(hen)大(da)程度上克(ke)服了(le)RNAi用(yong)于全基因组筛(shai)选时的(de)(de)脱靶效应。现在(zai)(zai)他们通过(guo)系统改良(liang)进一步(bu)增(zeng)强了(le)shRNA的(de)(de)活性,向人们展示了(le)靶标人类和(he)小鼠基因组的(de)(de)新(xin)一代shRNA文库。这一成(cheng)果发表(biao)在(zai)(zai)近期的(de)(de)美国(guo)国(guo)家科学院院刊PNAS杂志(zhi)上。

  

生物(wu)(wu)通报道:基(ji)因(yin)筛选是(shi)经典的生物(wu)(wu)学研究方法,可(ke)以鉴(jian)定在(zai)某(mou)一生物(wu)(wu)学过程中(zhong)起作用的基(ji)因(yin)。哺(bu)乳动物(wu)(wu)细胞(bao)的基(ji)因(yin)筛选一般是(shi)在(zai)RNA干扰(RNAi)的基础上进行的。

1998Andrew Fire Craig Mello两位科学家首(shou)次(ci)在线(xian)虫(chong)中(zhong)证明了RNAi的存(cun)在,他们也因此获得了诺贝尔生(sheng)理/医学奖。2001年马(ma)普研究所的(de)科学(xue)家(jia)们又在哺乳动物中发现了RNAi特(te)异性(xing)沉默机制。这一技术(shu)随(sui)即(ji)成为了反向遗传学的(de)重要工具(ju),被视为靶向任何(he)基因(yin)的(de)“神奇(qi)子弹”。

RNAi是(shi)通过引入siRNA或(huo)者shRNA,让细(xi)胞降解(jie)相应的(de)mRNA,通过(guo)功能(neng)缺(que)失表型来进行(xing)基(ji)因筛选(xuan)。不过(guo)RNAi比较容易出(chu)现错误(wu),siRNA/shRNA的(de)脱靶(ba)效(xiao)应会引起假阳性结果,siRNA/shRNA缺乏活(huo)性会(hui)引(yin)起假阴性结果。

此(ci)前,加州大学旧金山分校的研究团队(dui)通(tong)过建立超(chao)复杂混合(he)shRNA文库(ku)(ultracomplex pooled short-hairpin RNA libraries),在很大程(cheng)度上克(ke)服了RNAi用于全基因组筛选时(shi)的(de)脱靶(ba)效(xiao)应。现在(zai)他(ta)们(men)通过系统改良进一步(bu)增强了(le)shRNA的活性,向(xiang)人(ren)们(men)展(zhan)示了靶标人(ren)类和小(xiao)鼠基因(yin)组的新(xin)一代shRNA文库(ku)。这一成果发表在近期的美国(guo)国(guo)家(jia)科学院院刊PNAS杂志(zhi)上,文(wen)章的资(zi)深作者(zhe)是(shi)加州大(da)学旧金山分校(xiao)的Jonathan S. WeissmanMartin Kampmann

Weissman等人(ren)之前还开发(fa)过(guo)基于CRISPR的(de)基因筛选技术,称为CRISPR干扰(CRISPRi)。CRISPR原(yuan)本是细菌抵(di)御病毒的重要武器(qi),现在它已经成为(wei)了科学研究的强大工具。虽然CRISPRi在(zai)哺乳动物细(xi)胞中有很(hen)大的(de)应用潜(qian)力,但在(zai)某些情况下RNAi筛选依然是研究者们的首选。(延伸阅读:Cell重要(yao)成果(guo):基因(yin)表达沉默(mo)新技术

在这项研究中,研究人员(yuan)对自(zi)己的shRNA文(wen)库进行了(le)多方面的(de)优化,包括向导链的(de)选择以及shRNA表(biao)达的(de)启动子和microRNA环境。他们还(hai)考虑到了筛选后的样本制备,以便进(jin)行深(shen)度(du)测序。研究人(ren)员(yuan)建立了靶向人(ren)类和小(xiao)鼠蛋(dan)白(bai)编码基因的新(xin)一(yi)代文(wen)库(ku),并根据生物学功能将其分为12个(ge)亚(ya)文库。  

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研(yan)究表明,新(xin)一代RNAi文(wen)库(ku)在测试中(zhong)的表现与(yu)CRISPRi旗(qi)鼓(gu)相当(dang),能够(gou)获得高(gao)灵敏度和高(gao)特(te)异(yi)性(xing)的互补性(xing)结果。

 

生物通(tong)编辑:叶予

生物通推荐(jian)原文:Next-generation libraries for robust RNA interference-based genome-wide screens

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